恢复上肢功能对于中枢麻痹患者至关重要，而在神经系统障碍患者中，手部控制是优先事项。通过植入式电极针对周围神经系统的功能性电刺激，有潜力选择性地招募手部肌肉，产生多种功能性手部动作。然而国内正规配资平台，在前臂或肘部区域植入电极需要多次切口进行手术，肘关节无法进行动作。本研究中，我们设计并植入了一只日本猕猴（Macaca fuscata）远臂丛神经的正中神经和桡神经两侧神经上膜袖带。袖带通过腋下法单一切口成功植入。通过电刺激支配与正中神经和桡神经相关的手部、前臂和肱三头肌的收缩模式。靶肌的电位诱发电刺激远端臂丛神经，使其可靠且有选择地支配功能群层面的上肢肌肉。我们的结果表明，远端臂丛丛可以作为上肢肌肉收缩的有效刺激部位，腋下通道则使电极能够安置到上肢控制所需的周围神经。
一、引言
功能性电刺激（FES）是一种治疗方法，涉及使用温和的电脉冲刺激肌肉或神经，以帮助恢复因中枢神经系统（CNS）损伤而瘫痪的个体的上下肢功能。上肢和手部功能对于执行日常活动和提高神经系统损伤患者的生活质量尤为重要。先前的研究在运动神经假体中使用表面或植入式FES系统来控制手臂和手部。
表面FES在康复期间更常应用于临床，因为它是非侵入性的。临床研究已证明使用表面FES改善中风康复以恢复上肢运动功能的有效性。柔性多电极阵列等创新技术已被整合以产生更具选择性的刺激。然而，表面电极应用于皮肤，因此存在一些局限性：它们仅适用于靠近皮肤的原动肌，选择性支配单个肌肉的能力有限，需要更大的电流，并具有导致疲劳的反向募集效应。侵入性程序可以是提高选择性和性能的更可靠方法。
展开剩余92%针对周围神经系统分支的植入式FES是肌肉募集的替代策略。研究小组专注于正中神经、桡神经和尺神经，以产生选择性的功能性上肢运动。最近的研究展示了微加工横向束内多通道电极选择性募集外在和内在手部肌肉的潜力，在三只猴子中产生了多种功能性握持和手部张开。束内电极通过穿透神经外膜和束膜，定位在靠近不同肌肉传出轴突的神经束内。然而，针插入与损伤和炎症风险增加相关。神经外膜套袖电极是另一种多触点周围神经接口，已在旨在恢复瘫痪后手部功能的临床神经假体中实施。电极放置在神经表面以避免束组织损伤。可以将精确刺激传递到束的一小部分，从而实现选择性肌肉激活。
臂丛是穿过颈后三角进入腋窝的神经纤维网络。其解剖结构允许从单一近端位置进入多个周围神经分支并支配肌肉，减少多个电极的放置，并简化手术程序。在先前的研究中，我们验证了使用单一手术方法进入上肢周围神经的潜力。我们成功地在臂丛水平控制了上肢的四条周围神经（正中神经、桡神经、尺神经和肌皮神经）上植入了神经外膜套袖。
在这项研究中，我们在臂丛远端近端水平的两条周围神经上植入了神经外膜多触点FES套袖，旨在评估其选择性支配上肢目标肌肉的能力。使用单一小型腋窝皮肤切口接近所有五条神经（正中神经、桡神经、尺神经、肌皮神经和腋神经）以支配整个上肢是可能的。然而，在这项研究中，我们专注于刺激正中神经和桡神经，因为这两条神经支配前臂和手的主要屈肌和伸肌。获得了募集曲线以量化各种刺激参数对多个触点的选择性。
二、材料与方法
2.1 非人灵长类动物模型
在这项研究中，我们使用了一只体重10.2 kg的成年雄性日本猕猴（Macaca fuscata）。日本猕猴具有与人类相似的解剖结构。该猴子健康，没有表现出神经系统损伤的迹象。实验方案获得大阪大学医学研究生院（批准号04-025-000）和前沿生物科学研究生院（FBS-22-003-1）动物实验委员会的批准。所有实验方案遵循大阪大学医学研究生院和前沿生物科学研究生院的动物研究指南以及NIH动物护理指南。
2.2 神经外膜套袖
开发了神经外膜套袖以验证神经外膜套袖电极支配上肢目标肌肉的能力。为了减少电流扩散并潜在提高诱发肌肉的选择性，我们使用了三极刺激配置。在确认神经外膜套袖规格之前，对两只尸体猴子进行了神经解剖分析。这一过程提供了对神经套袖所需直径的深入了解。由CorTec（GmbH, Freiburg, Germany）开发的Pt/Ir 90/10螺旋神经套袖，具有3 × 6触点、自适应直径3 mm和长度30 mm（图1B）。我们还设计了一个经皮连接器作为植入套袖与刺激器之间的接口（图1C）。
图1. 本研究采用的方法总结。(A) 植入两个神经外膜套袖（正中神经和桡神经）准备进行刺激测试的猴子。(B) 定制Pt/Ir 90/10螺旋神经套袖（CorTec GmbH, Freiburg, Germany）的示意图，由3 × 6电极组成。(C) 带密封盖和记录盖的经皮连接器。(D) 腋窝入路5.5 cm皮肤切口以进入臂丛。(E) 套袖植入的术中照片。(F) 显示植入套袖位置的解剖结构图。(G) 猴子上肢由正中神经和桡神经支配的屈肌和伸肌示意图。(H) 不同刺激配置显示阴极（红点）和阳极（黑点）的位置。
2.3 手术程序
在异氟烷（1-3%，吸入）全身麻醉下无菌进行手术，并持续监测猴子的状况和生命体征。麻醉后，将猴子仰卧位放置在手术台上。在左上肢从喙突向肱骨做5.5 cm直线皮肤切口（图1D）。使用双极电凝器仔细止血。钝性分离胸三角沟以显示臂丛，在那里可以通过半透明结缔组织观察神经纤维。游离正中神经和桡神经最靠近臂丛远端的近端部分，使其与周围组织分离。使用术中电生理刺激来识别目标神经。将神经外膜套袖轻轻植入正中神经和桡神经（图1E,F）。
将急性EMG电极对（NE-215B, Nihon Kohden, Japan）插入每个目标肌肉腹中，允许电极间距为10 mm的双极电极配置。我们选择了四条主要由正中神经支配的手部和前臂屈肌，以及三条由桡神经支配的伸肌（图1G），其中指浅屈肌（FDS）产生手指屈曲，桡侧腕屈肌（FCR）实现腕屈曲，第一背侧骨间肌（FDI）和拇对掌肌（OP）完成手指对掌；指总伸肌（EDC）产生手指伸展，桡侧腕短伸肌（ECRB）实现腕伸展，肱三头肌完成肘伸展。在皮肤入口处放置单一缝合以固定电极。使用电刺激辅助识别目标肌肉。此外，在左锁骨近端植入单一参考电极。实验后，将猴子唤醒并放置在自由活动条件下的观察笼中。卡洛芬（3 mg/kg，皮下注射）用作镇痛药，头孢曲松钠（25 mg/kg，肌肉注射）用作抗生素。
2.4 电生理学
在全身麻醉下对猴子的神经外膜套袖施加电刺激（图1A）。刺激期间，我们同时从七个目标肌肉记录复合肌肉动作电位（CMAPs）（表1和图1G）。所有刺激和EMG记录均使用处理器单元（RZ2; Tucker-Davis Technologies, United States）和受试者接口（SIM10-6, Tucker-Davis Technologies, United States）以及Synapse软件进行。一次性皮下针电极连接到针电极适配器（S-BOX16; Tucker-Davis Technologies, United States）。EMG活动以12,207 Hz的采样率采集，并使用20-500 Hz阶带通滤波器进行滤波。
表1. 用于EMG记录的肌肉、其功能和神经支配
电刺激以恒流电荷平衡阴极优先双相脉冲的形式施加。我们使用32通道ZIF-Clip头级（ZC32-P, Tucker-Davis Technologies, United States）输送脉冲宽度为150 μs、频率为1 Hz的脉冲。在不同实验条件下，我们将幅度从100 μA变化到4,000 μA，并对每个电流步骤进行六次重复。我们采用了不同的刺激配置：传统纵向三极、带转向的三极和横向三极（图1H）。在传统三极刺激中，我们使用五个阴极，而在横向三极刺激中，使用全部六个阴极。为了减轻疲劳的影响，我们在改变刺激阴极之间强制执行1分钟的休息期。
2.5 肌肉募集和选择性
通过记录从每个目标肌肉获得的CMAPs生成肌肉募集曲线。为每个刺激脉冲捕获50 ms数据窗口内的数据，跨越刺激开始前10 ms和刺激开始后40 ms。该过程使用Tucker-Davis Technologies Synapse软件设置并实时执行。
我们使用诱发CMAPs的峰-峰幅度来研究诱发肌肉反应与刺激强度之间的关系。实验期间记录的每个肌肉的最大CMAP幅度用于分别标准化每个肌肉的CMAPs，从而为每个肌肉产生标准化募集曲线。通过计算选择性指数（SI）评估每个肌肉的选择性。SI使用研究人员概述的方程计算如下：
SI_m = [CMAP_m - Σ(CMAP_n / (M-1))] / [CMAP_m + Σ(CMAP_n / (M-1))]
其中m是感兴趣的肌肉，M是肌肉总数，CMAP是标准化CMAP。SI计算范围从-1到1，其中-1表示所有非目标肌肉的完全激活和感兴趣肌肉的零激活，1表示目标肌肉的完全激活和所有非目标肌肉的零激活。所有计算均使用MATLAB（MathWorks, 2023a）进行。
2.6 组织学评估
经心脏灌注后解剖臂丛远端神经样本，并包埋在石蜡中进行组织学评估。胆碱乙酰转移酶（ChAT）用作胆碱能神经元的标志物，特异性标记运动神经元。冠状切片用Nissl和抗ChAT抗体进行免疫组织化学染色处理。
组织首先在121°C的柠檬酸钠缓冲液（0.1 M柠檬酸，0.1 M柠檬酸钠，pH 6.0）中进行抗原修复处理10分钟。用室温下3% H₂O₂甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶15分钟后，将组织与初级兔抗ChAT抗体（1:250, bs-0042R, Bioss, United States）在4°C下孵育过夜。用磷酸盐缓冲盐水（0.05 M PBS, pH 7.6）洗涤后，将组织与过氧化物酶二级抗体在室温下标记30分钟。切片在室温下使用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐显色。切片用Mayer苏木精复染并在显微镜下检查。使用显微镜以4×和40×放大倍数捕获切片图像，手动勾勒轮廓，并使用BZ-X800软件进行定量测量。
三、结果
3.1 电极植入
我们通过腋窝入路5.5 cm皮肤切口，成功将两个套袖电极植入臂丛远端正中神经和桡神经的最远端部分（图1D-F）。该入路适用于在多达四条控制整个上肢的神经上放置神经外膜套袖。然而，腋神经位于腋动脉后方，被大圆肌遮挡，难以接近。此外，我们调查了植入区域的束横截面积。我们的结果显示，正中神经有单个大束，桡神经有一个较大直径的束伴随几个较小直径的束（图2A,B），取自植入部位（图1F）。ChAT染色的免疫组织化学结果揭示了正中神经和桡神经每个束内运动神经元的异质分布（图2A,B）。慢性电极阻抗测量表明阻抗相对稳定（图2C）。植入后1个月，募集的10%激活阈值逐渐降低，表明电极与神经表面之间的微环境稳定（图2D）。植入后45天纵向三极刺激的选择性指数（图2E）显示植入物的性能相对稳定。
图2. 猴子臂丛远端正中神经（B1）和桡神经（A1）的束形态。ChAT标记的正中神经（B2,B3）和桡神经（A2,A3）横截面显示束的映射（由虚线勾勒）。(C) 植入后45天所有电极平均结果的阻抗变化。(D) 激活电荷阈值（10%募集）的慢性评估。(E) 植入后45天三极刺激选择性指数的变化。
3.2 肌肉募集和选择性
对神经外膜套袖进行电刺激后，观察到与支配周围神经相关的肌肉典型收缩模式。记录的CMAPs证实了正中神经和桡神经上的电刺激支配了所有记录的上肢肌肉。随着刺激幅度从阈值下增加到饱和，峰-峰响应增加直至饱和（图3, 4）。
图3. 诱发的复合肌肉动作电位和募集曲线。(A) 正中神经刺激期间获得的五个纵向三极配置的募集曲线。x轴已缩放以专注于阈值下和饱和区域之间的过渡阶段。(B) 从不同刺激幅度记录的FDS（指浅屈肌）诱发的复合肌肉动作电位（刺激开始于0 ms）。
图4. 诱发的复合肌肉动作电位和募集曲线。(A) 桡神经刺激期间获得的五个纵向三极配置的募集曲线。(B) 从不同刺激幅度记录的ECRB（桡侧腕短伸肌）诱发的复合肌肉动作电位。
刺激开始与记录的CMAPs之间的时间延迟对于正中神经和桡神经均约为6 ms。这表明在猕猴中通过直接支配运动轴突实现了前臂肌肉募集。
募集曲线显示了所有五个三极组中正中神经（图3）和桡神经（图4）刺激期间上肢肌肉的标准化激活。为了直观澄清募集顺序，我们专注于募集曲线中对应于阈值下和饱和响应之间范围的区域。我们的结果显示，刺激正中神经时对FDI和OP的特异性，而刺激桡神经时肱三头肌比ECRB和EDC表现出更早的顺序。这些结果表明，当在臂丛远端刺激周围神经时，近端肌肉群比远端肌肉群具有更低的阈值。
为了实现同一组内肌肉更具选择性的支配，我们通过改变配置和脉冲宽度测试了不同的刺激参数。与纵向三极配置相比，横向三极和带转向的配置增加了阈值下、饱和和跨度，可以区分来自同一组的两个肌肉的募集曲线（图5A）。更完整的图见补充图1, 2。较短脉冲宽度的刺激需要更高的幅度才能达到募集阈值（图6）。然而，修改刺激配置和脉冲宽度的效果仅限于支配同一组中的不同肌肉。
图5. 不同刺激配置的比较结果。(A) 正中神经（上）和桡神经（下）纵向三极、带转向的三极和横向三极刺激的募集曲线。(B) 正中神经和桡神经选择性肌肉激活总结。使用不同刺激配置实现每个肌肉的选择性。深色线表示选择性指数。每个极坐标图的颜色区分每个肌肉。
图6. 正中神经纵向刺激期间比较不同刺激脉冲宽度的募集曲线。
此外，我们使用SI量化了三种三极刺激的肌肉收缩选择性，SI反映了相对于非目标肌肉每个肌肉的标准化激活。每个肌肉的最大选择性指数和相应配置概述于表2和图5B。
表2. 上臂肌肉的最大选择性指数和相应刺激方案
四、讨论
我们使用腋窝入路单一5.5 cm皮肤切口，在日本猕猴臂丛远端近端的正中神经和桡神经最近端部分植入两个定制的神经外膜套袖电极。臂丛远端水平的电刺激证明了在功能组水平选择性支配上肢肌肉的能力。我们的结果强调了臂丛远端刺激控制整个上肢的可行性。
在这项研究中，我们验证了臂丛远端可以成为FES控制所有上肢肌肉的有用刺激部位。先前的研究在不同部位的上肢周围神经植入电极，通常正中神经电极放置在肘部附近，桡神经电极放置在髁附近。然而，这种策略需要每个电极与连接器之间更长的电缆，使手术程序复杂化。此外，通过刺激肘部无法支配肱二头肌（肌皮神经）和肱三头肌（桡神经）。进入肌皮神经的一种可行方法是腋窝入路，针对臂丛远端分支。
臂丛是连接颈根与上肢运动和感觉神经的神经纤维网络。这一解剖特征使得通过单一腋窝入路容易接近并在所有五条支配上肢的周围神经上放置神经外膜套袖成为可能。这突出了产生包括肱三头肌在内的整个上肢肌肉控制的可行性，肱三头肌是负责肘伸展的主要肌肉。腋窝入路是进入臂丛的最流行方法。该入路只需要一个小皮肤切口，从而减少手术部位并简化多套袖植入设备的布线系统。
发现臂丛远端的神经外膜募集可以参与手和手臂的内在肌肉，并选择性激活大量屈肌和伸肌。手臂神经的束拓扑显示，在束中，深部中间纤维支配远端肌肉，浅表纤维支配近端肌肉。我们的结果显示，较低幅度的刺激可以支配近端肌肉，随着刺激幅度的增加，更深层的纤维被激活，允许支配更远端的手部肌肉。此外，阴极的刺激位点不影响募集选择性。然而，我们无法在同一功能组中差异刺激每个肌肉（例如，FCR和FDS都支配腕屈曲）。臂丛远端运动纤维分布的横断面检查显示一个主要大束伴随较少亚束，表明难以选择性匹配目标肌肉与终末分支纤维的特定区域。我们尝试了三种不同的刺激配置（纵向三极、带转向的三极和横向三极）以及不同的阴极位点以选择性激活深层纤维；然而，效果并不令人满意。
肘部水平的束内横向束内募集产生精细的手部运动。然而，髁段桡神经的刺激不能激活肱三头肌，无法实现肘关节伸展。我们的结果显示，通过神经外膜刺激获得的最大选择性值高于使用束内刺激获得的值（表2）。这可能归因于神经外膜刺激对靠近神经表面的运动纤维相对较高的选择性募集，以及对神经内部深层纤维相对较弱的募集。此外，由于束内电极的设计，只能施加单极刺激。与单极电极相比，三极配置可以实现对刺激电场的更好控制。
由于损伤或疾病导致CNS损伤后手臂的持续运动障碍，如中风患者和不完全脊髓损伤患者，可能使患者在日常活动中功能上依赖他人。神经外膜FES可能是诱导瘫痪肌肉收缩和执行基本关节活动的有用工具。完全截瘫和四肢瘫患者上肢的功能运动控制仍然充满希望。刺激具有长期功能和锻炼的优势。植入式电极放置在神经周围，在小部分束上输送较小电流，从而实现对目标肌肉的更具选择性激活并减少疲劳的发生。我们的神经外膜套袖设计为适应多种神经直径而不损伤周围神经，从而延长稳定植入时间。先前对猴子和人类上肢肌肉和神经的解剖学研究揭示，手臂结构在灵长类动物中得以保留，表明我们在猴子中的方法可以转化到人类。
感觉纤维也在正中神经和桡神经的每个束中发现，具有异质分布（图2A,B）。对传入感觉纤维的不必要激活可以通过脊髓中运动神经元的突触募集（H反射）促成诱发的肌肉收缩。然而，感觉轴突比运动轴突具有更长的强度-持续时间时间常数和更低的基强度，更优先被较宽脉冲宽度（0.5-1 ms）和较低刺激幅度募集。我们的刺激脉冲宽度限制较短（75 μs, 100 μs, 150 μs），优先激活运动纤维。EMG记录的CMAPs结果（图3B, 4B）显示约5 ms的短起始潜伏期，表明肌肉反应由直接周围通路介导，而非跨突触Ia介导的反射反应。
本研究存在一定的局限性。在这个早期阶段研究中，我们只植入两个套袖在桡神经和正中神经上以简化实验。我们没有使用药理学神经阻滞来抑制脊髓回路的影响。急性EMG电极在每个实验日插入略微不同的点，导致选择性分析中的一些差异。在未来的实验中，建议采用慢性EMG记录方法以最小化这种影响。
下一步，需要更高频率而非单一脉冲的神经外膜刺激来产生功能性关节运动。此外，在所有四条神经（正中神经、桡神经、尺神经和肌皮神经）上放置套袖以测试功能性运动和任务。手术入路还需要进一步优化以可靠地接近腋神经。在刺激方法方面，必须测试更多刺激模式和参数以提高诱发肌肉的选择性。具有无线充电线圈和可充电电池的完全植入式设备是电极长期植入的另一项重大改进。对于长期研究计划，可以通过将其与用于运动控制的脑-机接口技术相结合来改善FES效果。我们期望本研究将开发脑控制周围神经FES接口研究以支持上肢功能，并进一步造福神经系统损伤患者。
五、结论
臂丛远端可能是使用腋窝入路单一皮肤切口进行功能性电刺激的有用刺激部位。臂丛远端水平的电刺激证明了在功能组水平选择性支配上肢肌肉的能力。阴极的刺激位点不影响募集选择性。我们的结果强调了臂丛远端刺激控制整个上肢的可行性。
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